兔场实验室细菌培养技术

细菌的分离培养是兔场实验室诊断中非常重要的一步。通过细菌的分离和纯培养，可根据菌落的形状、大小、结构、颜色、气味以及有无溶血情况进行初步鉴定，然后通过进一步染色镜检或特殊培养进行鉴定或研究。为病原的诊断提供依据。

1、培养基制备培养基是细菌学检验过程中非常重要的材料。它含有细菌生长所需的营养物质。只有通过对培养基中细菌进行纯培养，才能得到准确的检查和可靠的结果。

(1)肉水的制备：

原料：瘦牛肉500克，蒸馏水（或普通水）1000毫升。

做法：瘦牛肉去脂、筋，切块或绞碎，按1公斤牛肉与2000毫升水的比例浸泡隔夜，煮沸一小时，用纱布初步滤去杂质。肉渣，挤出肉水。然后用滤纸过滤补足原量的水，放入烧瓶中，放入高压灭菌器中，120灭菌20分钟，制成肉水。

另一种制作肉水的方法是：取牛肉浸膏0.5-1.0克，加蒸馏水100毫升，加热溶解，用滤纸过滤，灭菌方法同上。

用途：用作制作各种培养基的基础。

(2)营养肉汤：

材料：肉水1000毫升、蛋白胨10克、氯化钠5克。

方法：将蛋白胨和氯化钠加入肉水中，稍加热溶解，用氢氧化钠溶液调节pH值至7.4-7.6，然后加热使溶液均匀。过滤、包装并高压灭菌以备后用。

用途：可用于一般细菌生长需要，检查细菌的生长性能，也可作为制作固体培养基的基础。

(3)营养琼脂：

材料：营养琼脂粉40克，蒸馏水1000毫升。

方法：将营养琼脂粉加入蒸馏水中，搅拌浸泡1小时，加热至充分溶解，高压灭菌备用。

用途：分离细菌纯培养物，并作为其他特殊培养基的基础。

(4) 血琼脂培养基：

材料：去纤血5-10ml，营养琼脂100ml。

方法：准备装有玻璃珠的灭菌锥形瓶，无菌采集血液，注入锥形瓶中，不断摇动直至血纤维分离，通常需要10分钟。

待高压灭菌的营养琼脂融化后，冷却至55-60时加入脱纤血。注意保证无菌操作。加入血液后，轻轻摇匀，防止产生气泡。立即将其倒入无菌板或等分试样中。储存在灭菌试管中以备后用。

目的：观察细菌的溶血情况。某些细菌的初始分离需要这种培养基。

(5)厌氧肝片肉汤：

材料：营养肉汤、动物肝片或肉渣、液体石蜡。

方法：用肉末、肉渣或少许动物肝脏作肉汤，放入试管中，加入营养肉汤5毫升，上层加入液体石蜡0.5-1.0毫升。 120消毒20分钟，备用。

用途：厌氧菌培养。

(6) 麦康凯琼脂：

材料：麦康凯琼脂粉38克，蒸馏水1000毫升。

制法：将麦康凯琼脂粉加入蒸馏水中，搅拌浸泡1小时，加热至充分溶解，高压灭菌备用。

用途：常用于大肠杆菌的分离培养。

2. 细菌接种法

(1)平板划线接种法：平板划线接种法是细菌分离培养中最常用的方法，可使细菌分散生长，形成单一菌落。左手握住培养皿，用拇指、食指和中指揭开培养皿。角度不应超过20度。用右手握住接种环。接种环与琼脂表面之间的角度约为45度。取少许病料涂于培养基边缘，对接种环进行火焰灭菌，待冷却后，轻触培养基边缘的病料区域，向一侧划一条水平线，连续小区域，对接种环进行火焰灭菌，冷却后，改变板的角度，从第一个细胞中抽出另一个细胞。然后按照同样的方法分盘，将其填满。请注意，它只能与起始位置处的前一个单元格相交。

(2)琼脂斜面接种法：此法多用于菌株的保存，也可用于细菌的分离。左手握住倾斜的培养基，右手握住接种环。火焰灭菌冷却后，挑取所需菌落。用右手小指握住棉塞或橡胶塞，轻轻转动，将其取出。注意不要污染管口并立即堵住。灭菌时，将接种环插入试管中，从斜面底部向管口画一条曲线，用火焰对管口和塞子进行消毒，然后盖紧培养。

(3)穿刺接种法：该方法适用于半固体、固体培养基和微发酵管的接种，用于细菌的生化和动力学实验。将培养管中心笔直刺入距管底约0.5cm处，然后沿穿刺线抽出接种针。

(4)液体培养基接种法：该方法与斜面接种法基本相同。将接种环在培养管壁液面下摩擦，然后在液体中振动数次，塞好，注意瓶塞和管口的消毒。

3. 细菌培养方法

细菌培养方法根据细菌的生长特性、培养目的、要求等而不同。主要分为以下几类：

(1)好氧培养法：即一般培养法。将细菌接种到培养基中后，即可在37培养箱中培养。适用于需氧菌和兼性厌氧菌的分离培养。

(2)二氧化碳培养法：某些细菌必须在一定的二氧化碳环境下才能良好生长。

烛罐法：将接种后的培养基放入干燥器中，点燃蜡烛，密封好，与容器一起放入培养箱中培养。

化学法：按照每升容器0.4克碳酸氢钠和3.5毫升盐酸的比例，分别放入两个小容器中，放入干燥器中，密封，使两种药物接触产生二氧化碳。

二氧化碳培养箱法：将培养基置于特制的二氧化碳培养箱中，可根据需要调节二氧化碳的浓度。

(3)厌氧培养法：

通气方法：将培养基放入干燥器中，将干燥器抽真空，然后充入氮气、氢气和二氧化碳的混合气，放入培养箱中培养。

焦没食子酸法：焦没食子酸在碱性溶液中形成焦没食子酸盐，能吸收空气中的氧气，从而创造出适合厌氧菌生长的厌氧环境。培养方法：将平皿盖揭开，翻转，放入1克焦性没食子酸，盖上一层脱脂棉，在脱脂棉上滴1毫升10%氢氧化钠，然后将接种过的平皿盖在翻倒的盖子。迅速用蜡密封，置于37培养箱中2-4天，观察结果。如果接种的培养基是试管，可以取一个大试管，底部放2克焦没食子酸，并加入10颗以上的玻璃珠。将培养基试管置于玻璃珠上，然后沿大试管壁加入10滴焦性没食子酸。 %氢氧化钠溶液，用橡皮塞塞紧大试管口，置于37培养箱中培养。

厌氧肝片肉汤接种：由于肝片或肉渣中含有谷胱甘肽，可发生氧化反应，降低环境中的氧化势能，有利于厌氧菌的分离。接种方法是用接种环钩挑起病材，接种到培养基中，在37培养箱中培养2-4天，观察结果。