报告题奶牛新孢子虫病诊断方法的研究进展

新孢子虫病是由犬新孢子虫Dubey(1988)寄生于狗、牛、羊等动物细胞引起的原虫病。挪威科学家Jcerkas 于1984 年首次在患有脑炎和肌炎的小狗中发现了这种疾病。 1988年，Dubey博士将其命名为犬新孢子虫[1]。犬新孢子虫的最终宿主是狗[2]，牛、羊、狗、马、鹿、小鼠等均可作为中间宿主。尽管新孢子虫病是许多家畜常见的原虫病，但它对牛的危害尤其大。主要引起流产、死产和新生儿运动神经系统疾病。同时，该病可垂直传播。携带蠕虫的奶牛可以将蠕虫直接传给刚出生的牛犊，已被证明是造成乳品行业严重经济损失的重要原因。由于我国每年从欧洲、美国及周边国家引进大量种牛或商品牛，因此该病极有可能传入我国。本病的防治关键在于诊断。因此，笔者对近年来国外学者对奶牛新孢子虫病的诊断方法进行综述，供同行参考。 1 临床诊断生前诊断主要依靠临床症状的观察。该病全年均可发生，但以夏季为高峰。雌性动物的感染没有年龄差异。妊娠6个月前流产的胎儿血清阳性胎儿比例较高，由此导致的流产往往是散发性或地方性的。因此，当产妇出现流产、死产、新生儿瘫痪、畸形、共济失调、肌肉萎缩、抽搐或其他运动神经系统疾病症状时，尤其是一组或多组出现此类症状时，应怀疑是否为新发疾病。孢子虫感染[3,4]。 2 病原学诊断2.1 组织病理学检查根据犬新孢子虫的寄生部位，在新生儿的肌肉、脑组织、呼吸道分泌物、皮肤脓疱等活检组织中可检出犬新孢子虫。应采集流产胎儿的脑、脊髓、心脏、肝脏等组织进行常规组织学检查。可见多灶性、非化脓性脑炎、神经炎、心肌炎、骨骼肌炎、肝炎和细胞浸润，但为了确诊，必须检测犬新孢子虫速殖子和/或组织囊肿[5]。 2.2 病原菌的分离培养为了分离培养犬新孢子虫病原菌，可收集待测动物材料的组织，匀浆后皮下接种于小鼠、大鼠、沙鼠、犬、猫、兔体内。等。疫苗接种剂量因动物种类而异。发病后，采集中枢神经系统或内脏组织进行特异性检测，也可进行传代接种。犬新孢子虫已在体外培养成功，可在牛肾细胞、Vero细胞等传代细胞系中生长发育。牛单核细胞和牛心肺主动脉内皮细胞通常用于培养。戴维森等人。 [6](1997)用0.5%胰蛋白酶匀浆约10g新鲜死产小牛脑组织，然后将其接种到6个Vero细胞上。在含有5% CO2 和95% 空气混合物的RPMI-1640 培养基中维持培养于37C。接种后29 天，在一种培养基中观察到典型的犬新孢子虫速殖子**。山根等人。 [7](1997)从16个疑似新孢子虫病的流产胎儿和小牛身上收集了组织样本，并将其接种到牛心、肺、主动脉内皮细胞和猴肾细胞培养物中。接种49天后，观察到部分细胞犬新孢子虫速殖子。这表明病原的分离和体外培养可用于新孢子虫病的特异性诊断。 2.3 寄生虫的免疫组化检查：采集死亡动物的脑、脊髓、肝、肾、胎盘或其他病变部位，切片并进行免疫组化染色。犬新丝虫血清可对寄生虫进行特异性染色，而弓形虫等原虫血清则不能，可做出特异性诊断[1, 8]。

亲和素-生物素-过氧化物酶染色（ABPC法）就是其中之一。 Lindsay 用兔抗犬新孢子虫血清对组织切片进行染色，可检测新孢子虫速殖子和缓殖子。但不感染弓形虫、哈维氏弓形虫、克氏肉孢子虫、果冻虫等，同时兔抗弓形虫血清不与犬新孢子虫发生反应[1]。 3 血清学诊断** 血清学检测对于牛流产的准确诊断、新孢子虫病传播的流行病学调查以及犬新孢子虫其他中间和终末宿主的鉴定是必要的。目前，已报道了多种检测牛新冠病毒抗体的血清学方法，包括间接荧光抗体试验（IFAT）、Western blot试验、凝集试验和ELISA检测方法。其中，IFAT和ELISA方法应用广泛，检测结果特异性和敏感性较高[9, 10]。 3.1 间接荧光抗体试验（IFAT）。将在Vero 细胞系中培养的犬新孢子虫固定在载玻片上。 IF-AT用于测定抗-N。血清和初乳中的犬IgG 抗体滴度。血清中的IFAT抗体滴度为1:200至1:1600，甚至高达1:6400。此外，还可以检查受影响动物的脑脊液中的抗体。该方法特别适用于犊牛先天性犬新孢子虫感染。该方法特异性强、灵敏度高。检测动物血清抗体时，血清稀释100倍后不会与弓形虫发生交叉反应[2,9,11]。 Okeoma 和Williamson 对269 份自然感染犬新孢子虫的牛血清样本进行了不同抗体滴度的IFAT 测试。结果表明，虽然抗体滴度有所波动，但IFAT滴度相同的组中犬新孢子虫抗原的染色体条带模式仍然相同，该方法可用于犬新孢子虫速殖子抗原的鉴定[12]。 3.2 酶联免疫吸附试验（ELISA） 现有研究中，ELISA检测方法主要基于全部或部分纯化的天然N.aninum抗原或重组N.canmum抗原，或N.can-inum抗体活性和N.caninum基于特异性竞争性抑制性单克隆抗体（MAb）。目前，已开发出最先进的ELISA诊断试剂盒。其中，基于犬新孢子虫单克隆抗体（MAb）和表面抗原的ELISA检测方法应用广泛，其诊断特异性和敏感性较高[9,10,13]。 3.2.1 ELISA 目前，已开发出最先进的犬新孢子虫ELISA诊断试剂盒。 Williams等[14]等学者评估了ELISA试剂盒检测牛血清N.cqninum抗体的有效性，并与IFAT检测结果进行了比较。根据试剂盒的说明进行测试。检测结果小于20pp的样本视为阴性，20-25pp范围内的样本为可疑样本，大于25pp的样本为阳性样本【pp为检测样本与阳性对照血清的OD值（IFAT效价为1:5120） ) 平均OD 值的百分比]。结果表明，该方法与IFAT检测结果一致性较高，且更可靠、特异、灵敏。此外，ELISA方法还可用于检测牛奶中的犬新孢子虫抗体。 Schares G、Barwald A等人应用ELISA检测牛奶中的新孢子虫抗体。他们指出，稀释比例为1:2的牛奶可以获得与相应血清检测呈线性相关的实验结果。 [15]。临床试验结果表明，Biovet ELISA 试剂盒和IDEXX ELISA 试剂盒的特异性和敏感性均大于95%，可作为检测牛N. caninum 抗体的唯一方法[14]。 3.2.2 MAb-cELISA 基于Baszler等人的原始研究。 [16](1999)改进了基于单克隆抗体(MAb 4A4-2)的竞争性抑制酶联免疫吸附测定(cELISA)。

改良的cELISA方法使用特异性单克隆抗体（弗氏完全佐剂中的5B6-25）捕获天然犬新孢子虫抗原，并将其直接与竞争性单克隆抗体（MAb 4A4-2）结合，这两种单克隆抗体可以结合不同的表位并且是保守的，并且它们都主导针对65-Kda 犬新孢子虫速殖子表面抗原（Nc-1 分离株）的免疫。 cELISA 方法减少非特异性抗体结合，并允许使用未稀释的血清以确保诊断特异性和敏感性。实验结果表明，诊断灵敏度为97.6%，诊断特异度为98.6%，表明该方法对犬新孢子虫阳性和阴性样本具有敏锐的识别能力。 N. caninum cELISA 的特异性取决于MAb 4A4-2，它可以直接与抗原结合。因此，没有必要对cELISA 和其他辅助测试（如凝集测试）进行改进。 cELISA 是一种准确、灵敏且准确的检测牛新丝虫抗体的方法[9,13,17]。 3.2.3 基于犬新孢子虫表面抗原的ELISAN。犬表面存在多种抗原，犬新孢子虫主要表面抗原可作为新孢子虫病的重要诊断剂。 NcSAG1 是犬新孢子虫的主要表面抗原。查汉等人。克隆了编码缺少信号肽和C端疏水功能区的NcSAG1的基因（NcSAGlt），并将其与谷胱甘肽-S转移酶（GST）一起作为融合蛋白在大肠杆菌中表达。纯化的GST-NcSAG1t 用于ELISA 检测牛新孢子虫抗体。该方法可以准确区分IFAT阳性和阴性牛血清，并且不会与实验感染弓形虫的小鼠产生交叉反应[18]。 Howe和Tang [19] (2002)研究了N. eaninum的主要表面抗原rNcp29，并设计了rNcp29r ELISA来检测牛血清中的特异性抗体。 Ncp29由与弓形虫特异性SAG1基因同源的基因组成。就编码而言，它是一种重组表面蛋白。实验结果表明，该方法能够快速区分犬新孢子虫血清阳性牛（[OD]大于1.2，稀释度为1:500或更高）和阴性对照组（[OD]OD]小于0.5，稀释度为1:500）。另外，弓形虫或克氏肉孢子虫动物体分离血清的ELISA检测结果为阴性，因此rNcp29r ELISA对于检测犬新孢子虫抗体具有高度特异性和敏感性。 Hye-Jin AHN 和Sera KIM 等人。 (2003)研究了另一种犬新孢子虫表面抗原Ncp43(犬新孢子虫韩国株)，其抗原表位位于分子C端2/3处(Son等，2001)，纯化的GST与2融合Ncp43（P片段）C端的/3（缺乏特征标签的相对较短的6xHis可用于替代GST），并用作抗原设计ELISA测试。结果表明，该方法能够准确检测特异性犬新孢子虫抗体，Ncp43与弓形虫TgSAGlA一起可用于不同哺乳动物中犬新孢子虫和弓形虫感染的鉴别诊断[20, 21]。此外，其他几种重组犬新孢子虫抗原如Nc4.1和Nc14.1也可以作为重组蛋白用于ELISA检测，以检测特异性犬新孢子虫抗体[19]。 4 分子生物学诊断目前，奶牛犬新孢子虫病最常用的分子生物学诊断方法是聚合酶链反应（PCR）。该方法主要基于犬新孢子虫特异性表面抗原，适用于感染细胞培养基和福尔马林固定石蜡包埋组织中犬新孢子虫病原体的检测。

4.1 间接原位PCR 该方法是Loschen-berger等人研究的检测犬新孢子虫的新方法。 （2004）。具有较高的特异性和敏感性，可以替代免疫组化方法。它可以通过半抗原检测犬新孢子虫标记的核苷，通过PRINS反应检测，也可以通过荧光染色体标记抗体显示[22]。 4.2 Nc-5基因的PCR检测Paula等。 (2004) 从12 个2 岁母牛胎儿的临床样本中采集了血液，这些胎儿在妊娠5 个月时流产并分离了DNA。他们使用Np21+和Np6+引物对检测犬新孢子虫的NC-5基因。对350 bp 片段进行PCR 扩增，并使用Tim3 和Tim11 引物对扩增内部转录阻断剂1 (ITSI)。证明该方法的有效性[23]。 Fernandez 和Mora (2002) 设计了一种二次PCR 方法来定量检测流产牛胎儿中的犬新孢子虫。他们设计了寡核苷酸引物来扩增犬新孢子虫Nc-5 序列的76 bp DNA 片段的相应基因。结果表明该PCR方法可用于新孢子虫病的定量检测[24]。此外，Mller 和Vonlaufen (2002) 设计了二次荧光PCR 测试来定量检测小鼠中枢神经系统组织切片中的新孢子虫。该PCR采用双荧光杂交技术，可以准确检测脑组织中的新孢子虫。冲[25]. 4.3 单管巢式PCR El-lis，McMillan 等人。 [26] (1999)描述了一种单管巢式PCR技术，具有两个连续步骤来检测新孢子虫。 ）这种PCR诊断方法对目标序列的特定复制产物特别敏感，可以从自然感染的牛和狗分离的福尔马林固定、石蜡包埋的组织样本中扩增犬新孢子虫DNA，达到临床诊断目的。 PCR MIMIC也已被描述，需要更深入的研究来证实该技术在研究犬新孢子虫生物学特性中的作用。 5 结论综上所述，奶牛犬新孢子虫病的诊断应结合临床症状、流行病学及病理组织学变化特点，采用多种检测方法进行综合诊断。血清学检测和PCR检测是诊断奶牛犬新孢子虫病的唯一方法。基于犬新孢子虫特异性表面抗原和竞争性抑制性单克隆抗体的特异性PCR检测和ELISA方法具有较高的诊断特异性和敏感性，适用于感染细胞培养基中的病原体和前体。在海洋固定、石蜡包埋的组织中检测犬新孢子虫病原体。在实际工作中，我们必须根据实际情况，采用相应的方法来诊断奶牛新孢子虫病。